专题分享组织工程化关节软骨研究进展
来源：本文刊登于《中国医疗器械信息》杂志年10月（上半月刊）17-23页
作者：来灿钢1张泽宇1李青2俞燕飞1厉驹3
单位：1杭州启迪生物科技有限公司（杭州）
2医院骨科（萧山）
3医院骨伤科（杭州）
内容提要：关节软骨属于无血管的组织，炎症的反应是由软骨细胞、滑膜组织分泌的细胞因子所介导。关节软骨损伤后自身修复能力有限，损伤后的修复成为临床急需解决的问题。因此，关节软骨损伤修复成为研究者和临床工作者的研究热点，本文就目前关节软骨组织工程研究进展作一综述。种子细胞、支架和细胞因子是关节软骨组织工程的三大要素，三者必须协调发展和互利。现阶段组织工程方法修复关节软骨损伤的研究已取得很大进展，组织工程修复关节软骨损伤这项技术已成功应用于临床，取得了明显的效果。随着新材料的不断研发，新的组织工程软骨修复材料将兼顾材料学和生物学的需要，使其更接近机体自身组织生物学特性，使关节软骨损伤修复取得突破性进展。
关键词：关节软骨组织工程关节软骨种子细胞支架细胞因子
0.引言关节软骨为覆盖关节表面的一层光亮的结缔组织，富有弹性，摩擦系数小，能吸收关节间的振荡，是机体重要的力学器官之一[1]。关节软骨内无血管、神经及淋巴液供应，对创伤、炎症的反应是由软骨细胞、滑膜组织分泌的细胞因子所介导。关节软骨内含有多种细胞因子，而且关节软骨细胞能自分泌多种细胞因子，在促进软骨细胞增生、分化、凋亡或引起基质降解中起着重要的调节作用。
一直以来大家都认为关节软骨损伤不可修复，对于软骨损伤的治疗只采取口服药物，任关节软骨继续磨损直至需要进行关节置换。但随着新技术的发展，尤其是组织工程技术的发展，现在可以采用病人的细胞复合一些支架做为软骨的补片来修补损伤的软骨。
组织工程修复关节软骨损伤这项技术的问世，已经打破了“关节软骨一旦损伤，不可恢复”这一传统观念，为患者带来了福音。
种子细胞、支架材料以及细胞因子是组织工程研究的主要内容，具体到软骨组织工程，其基本方法是提取自体或异体软骨细胞或软骨前体细胞[2,3]。经体外扩增后，吸附于一种生物相容性好并可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质上，该材料可以为软骨细胞提供适合其生存的三维空间，有利于软骨细胞获得足够的营养物质，使软骨细胞按预制形态的三维支架生长，然后将这种软骨细胞-生物材料复合体移植入体内病损部位，在生物支架降解的过程中，种植的软骨细胞继续增殖并分泌软骨基质，最终形成新的具有原来特殊形态和一定功能的软骨组织。
1.种子细胞种子细胞是组织工程的重要因素之一，包括软骨细胞和干细胞。软骨细胞则包括自体软骨细胞和同种异体软骨细胞，胚胎软骨细胞；干细胞主要包括骨髓间充质干细胞[4]、脂肪干细胞、胚胎干细胞、脐血干细胞、外周血干细胞等。种子细胞的选择多种多样，各有利弊。
1.1自体软骨细胞：自体软骨细胞是最好的软骨组织工程细胞来源，但来源有限，多采用关节镜检或关节穿刺取关节非负重区软骨，容易引起关节损伤，且随着年龄的增长，软骨细胞增殖速度减慢。因此，研究者尝试改变软骨细胞的培养环境，生物反应器应用于软骨细胞培养初步解决了这一关键问题。生物反应器能够提供细胞生长黏附材料，还方便施加物理学影响，为细胞生长、分化提供适宜微环境，又解决了营养物质和代谢产物的更换等问题，更有利于组织工程软骨的培养[5]，使软骨细胞实现其在体外大规模培养并促进有关生长因子的分泌。年，Smith等[6]发现间断和持续压力作用于软骨细胞4h后，Ⅱ型胶原等成分分泌明显提高。Falsafi等[7]发现软骨细胞在体外微重力环境培养可迅速增殖，呈高密度聚集，形成较大的软骨组织样结构。
1.2同种异体软骨细胞：当软骨缺损深至软骨下骨或者缺损面积较大时，患者自身无法提供足够的自体软骨细胞时，则需要同种异体软骨细胞。Aubin等[8]应用新鲜异体骨软骨移植治疗了72例股骨髁远端的软骨损伤，其中60例获得了平均10年的长期随访，结果有85%的患者移植体存活，关节功能良好。
同种异体软骨细胞修复软骨损伤技术已经发展至第四代。第一代技术是用自体骨膜将软骨缺损处缝合，再注入体外培养细胞。该技术的缺点在于需重新开切口取骨膜，容易造成手术切口较大或存在两个切口。第二代技术相比较较第一代技术其优点在于无需取骨膜，直接使用生物胶原膜覆盖，手术时间短，而且无需开第二个切口。但一、二代技术都存在无法有效控制注入细胞悬液浓度及弥补组织修补缺损厚度等问题。第三代技术将细胞锚定在生物胶原膜上，解决了前两代技术的细胞悬液流失的缺点。第四代技术研发了一种与正常软骨空间结构完全一样厚度的新型支架。该技术选择同种异体软骨，将关节软骨制成匀浆，然后进行脱细胞处理，得到了与天然软骨细胞外基质类似的二型胶原及其他细胞外基质成份做为支架的材料，该技术修复的软骨更接近于正常软骨。但新鲜的异体骨软骨细胞不易获得。
1.3胚胎软骨细胞：具有较低的抗原性和较强的增殖能力，有报道以其作为种子细胞修复关节软骨缺损获得了良好的效果，没有引起明显免疫排斥反应，修复组织也未见明显退变，可能是进行异体软骨组织工程构建的较好种子细胞，但其来源及其伴随的伦理问题是限制其应用的最大问题。
1.4骨髓间充质干细胞：是干细胞家族的重要成员，能定向诱导分化为软骨细胞，由于来源广泛，创伤小，易分离、培养、扩增。其作为种子细胞和免疫调节细胞在组织工程、器官移植、治疗免疫排斥和自身免疫性疾病，以及组织器官损伤疾病的领域中具有十分广阔的应用前景[9]。但是由于其受年龄限制，且存在致瘤风险，在一定程度上限制了临床应用[10]。
1.5脂肪干细胞：不仅与骨髓间充质干细胞（MSCs）具有相同的干细胞表面标志，也具有向骨、软骨、脂肪、肌肉和神经等细胞分化的能力[11~13]。体外扩增有稳定的细胞倍增时间以及较低的细胞老化水平，易获取，且不受年龄限制，无致瘤风险等优势，使脂肪干细胞成为骨组织工程种子细胞的研究热点之一，在组织工程领域研究应用广泛[14]。但其诱导向软骨分化具体机制尚不清楚，不同个体、不同部位的脂肪间充质干细胞的分化能力有明显差别原因尚不清楚，这些问题[15~17]还有待于进一步研究。
1.6胚胎干细胞：属于全能干细胞，具有多向分化潜能，能大量增殖并保持未分化状态。Kramer等[18]报道胚胎干细胞在BMP-2和BMP-4作用下分化为软骨，证实了胚胎干细胞作为种子细胞的可行性，但是其分化调控机制尚待进一步阐明。目前对于如何控制体外培养不分化或者体外定向分化为软骨细胞成为科研工作者亟待解决的问题，也因此制约着胚胎干细胞的临床应用。
无论是干细胞还是软骨细胞移植，如何保持细胞悬液在损伤部位的有效浓度是研究目标之一。多年来研究者主要通过研究新的细胞传递方式，维持细胞浓度。陈加荣等[19]利用超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞，利用磁力靶向将干细胞定位在关节腔内；杨建华等[20]将干细胞与藻酸盐凝胶介质构建成一个含有软骨细胞外基质的凝胶三维空间体系，将复合体植入裸鼠皮下异位构建组织工程软骨。然而，最新研究表明，由于归巢作用[21,22]的存在，可以将注入的细胞锚定在待修复部位，有效控制细胞悬液在损伤部位的有效浓度，从而达到修复缺损关节的目的。
目前关于干细胞的研究在很多方面取得了突破性的进展，但是在干细胞研究中仍有很多未知的领域需要不断探索。例如，干细胞分化调控的分子机制目前还没有完全清楚，是否具有形成复杂器官的能力，一系列的伦理学和社会学问题，在干细胞的应用研究中致瘤性风险[23~26]等，是干细胞临床应用亟待解决的问题。
2.支架材料支架材料是种子细胞与细胞因子参与修复软骨所必须的载体，为种子细胞提供了附着、增殖、分化和代谢的场所，也为细胞质分泌和旁分泌的细胞因子提供了暂时的附着点。
近年来，生物支架材料是构建组织工程软骨的研究热点之一。一些具有特殊功能的支架进入研究者的视野，逐步代替了传统的天然生物支架材料和合成支架材料。如复合支架材料、可注射的支架材料[27,28]（氧化海藻酸钠微球注射用的间充质干细胞（GMSCs））、药物定向释放支架材料[29]、仿生纳米支架材料[30]（羟基磷灰石/氧化钇稳定氧化锆支架）等。这些支架材料具有特殊的理化性质和功能，可以促进软骨细胞的粘附分化，从而形成更符合生理状态的组织工程软骨。
天然生物材料主要包括：胶原、纤维蛋白、明胶、壳聚糖、蚕丝蛋白、琼脂、糖胺多糖、藻酸盐类等。优点：生物相容性和弱抗原性良好，且材料本身含有特殊的氨基酸序列，有利于识别细胞表面黏附分子，并能维持细胞的分化状态。缺陷：是力学性能较差，降解速度快，难以大量制备，不同批次质量差异波动较大，且因其来自于天然生物体，故尚存在传播疾病的风险。
人工合成材料：人工合成高分子材料的微结构，机械性能及材料的降解时间等都可以预先设计和调控，目前常用的主要有聚乙烯醇、聚乳酸、磷酸二钙、聚乙丙酯、聚氨酯、聚乙烯氧化物、聚N-异丙基丙烯酰氨。优点：有良好的生物相容性，可降解性。缺陷：亲水性不够，对细胞的黏附性较弱，降解产物偏酸性可引起炎症反应，并且价格昂贵[31,32]。
复合材料：研究热点，即将两种或两种以上具有互补特征的生物相容性可降解材料，按一定比例和方式组合，可设计出结构与性能的三维材料，以弥补单用人工合成或天然生物材料的缺陷。目前复合材料有胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合支架、胶原-聚乳乙醇酸复合支架，聚乳酸-聚羟基乙酸聚磷酸钙纤维-胶原复合支架，聚己酸内酯/壳聚糖材料等。优点：克服了单一材料的缺点，又使其具有高机械强度、可降解、易加工制备及亲水性良好、细胞相容性较佳。
近年来，智能化软骨组织工程支架材料[33]的研究成为热点，利用工程学方法将有特定信号识别功能的生物分子与现有的材料结合成新一代有特定修复功能的三维支架上，使其兼具生物和人工合成材料的优点，即所谓“智能”材料。理想的智能材料应具有很强的生物活性，能对环境中的物理、化学和力学刺激性做出响应，从而控制细胞的黏附、增殖和分化等生物学行为。智能软骨化材料的问世，将会大大促进软骨组织工程领域的研究进程。
3.细胞因子从干细胞到软骨细胞的分化过程，直至关节软骨的形成，需要众多因子共同刺激，而且正常关节软骨中细胞代谢的维持也需要这些细胞因子的参与。细胞生长因子对软骨细胞的增殖、分化以及基因表达起着至关重要的作用。这些因子主要是由间充质细胞、血管内皮细胞及血小板等通过自分泌和旁分泌而来。
在软骨缺损的治疗过程中，采用适宜的方法，适时适量地引入特定的生长因子，有助于软骨缺损的修复与重建。目前，将生长因子运用于组织工程技术的方法主要有两种：（1）生长因子直接附和到支架上或者在支架构建后再与其复合；（2）在支架上移植能分泌生长因子的细胞，包括自然状态下分泌生长因子的细胞和基因工程化细胞。
3.1转化生长因子β（transforminggrowthfactorbeta，TGF-β）
TGF-β是具有多种功能的多肽生长因子。广泛存在于骨与血小板中，具有调节细胞的生长、分化、凋亡和细胞外基质的合成等多种生物学效应。也是当前最强的细胞促生长因子[34]。目前，在人体中已发现了5种类型的TGF-β，即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5。其中TGF-β1在软骨损伤修复中的作用较为重要。
TGF-β1通过两种途径促进软骨损伤修复：（1）发挥软骨诱导作用，促进肝细胞分化软骨；（2）促进软骨细胞合成蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，维持软骨细胞表型[35]。
TGF-β不仅能够调节骨、软骨细胞生长分化，还调节其他细胞因子在软骨中的表达与作用[36]。如TGF-β能增强碱性成纤维细胞生成因子（fibroblastgrowthfactor，FGF）促软骨细胞胶原和蛋白多糖的合成作用。TGF-β和胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）协同作用可使培养的大鼠关节软骨细胞DNA合成提高10.4倍；Dounchis等[37]发现TGF-β能刺激体外培养的骨膜细胞分化为软骨细胞，并表达Ⅱ型胶原。推测TGF-β3可以通过两种途径促进软骨损伤修复：既发挥软骨诱导作用，促进干细胞分化为软骨，同时又促进软骨特异性基质的合成，如Ⅱ型胶原、蛋白多糖。
3.2胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor，IGF）
IGF结构与胰岛素同源，受生长激素调节[38]。IGF是最早发现具有软骨生成作用的生长因子之一。正常关节软骨中IGF起着维持软骨细胞代谢稳态的作用，保持着体外蛋白多糖合成和分解的平衡。IGF-1具有促进关节软骨修复、促进软骨细胞增殖、维持软骨表型稳定、诱导间充质干细胞向软骨组织分化等作用[39]。
3.3血管内皮生长因子（VEGF）
在目前已知的生长因子中，血管内皮生长因子是诱导血管再生能力最强的生长因子，而且在软骨修复的过程中，血管内皮生长因子同样也起着非常重要的调节作用[40]。
3.4肝细胞生长因子（HGF）
肝细胞生长因子是20世纪六七十年代发现的一种能刺激肝细胞增殖的物质。能刺激软骨细胞迁移、增殖和蛋白多糖合成，在生理和病理上调控软骨生长[41]。
如何检测特定生长因子的水平，生长因子与愈合环境之间的相互作用，以及生长因子对修复细胞分化调控机制等还需要进一步阐明，以便更好地利用生长因子，确保在最佳时间以最佳剂量应用于软骨缺损的修复过程，为明确关节病变提供依据。
4.临床及其他方面的应用在临床应用方面，自体软骨细胞移植自年报道以来，至今已成功应用于临床20余年，是目前最成熟的修复软骨损伤的细胞治疗方法[42]。至今全球已开展了超过20万例病人的软骨细胞治疗[43,44]，效果明显，有效率达70~85%，6~11年随访结果表明自体软骨细胞移植的疗效稳定。尤其是医院第四代组织工程软骨技术运用，最长随访8年病例证明临床运用效果显著，彻底打破了关节软骨损伤不可以修复这一“定论”。
Heymer等[45]应用聚乳酸胶原纤维支架复合人骨髓间充质干细胞修复全层软骨缺损，3周后即可观察到Ⅰ型胶原纤维层形成，且纤维层的上1/3可见细胞分布均匀并明显向软骨细胞分化，其细胞外基质中富含蛋白多糖和Ⅱ型胶原，RT-PCR分析有软骨形成，说明聚乳酸胶原纤维支架具有修复软骨组织缺损的功能。
周晓中等[46]将骨髓基质干细胞分别种植于聚羟基乙酸和羟基磷灰石支架后共同培养，生物胶粘连两种支架-细胞复合物形成骨髓基质干细胞-聚羟基乙酸-羟基磷灰石复合体，并植入兔膝关节修复关节软骨。实验结果显示术后20周，实验组可见缺损处修复组织似透明软骨样，表面光滑。
Wakitani等[47]采用体外培养的兔自体骨髓间充质干细胞修复关节软骨全层缺损后，组织学评分发现术后3个月内缺损被软骨组织所修复。
Liu等[48]和Zhou等[49]分别通过Ⅰ型胶原和聚羟基乙酸羟基磷灰石双向支架复合骨髓间充质干细胞用于软骨组织工程均取得了满意的效果。
5.展望及存在的问题关节软骨组织工程的研究主要集中于种子细胞和生物支架两个关键因素上。种子细胞包括各种来源的干细胞和软骨细胞。种子细胞经过多年的研究，已经取得了巨大的突破，一些种子细胞已直接用于细胞治疗。目前，种子细胞的研究重点在于如何促进细胞在支架上的三维生长，如何维持细胞的表型，如何保持细胞悬液在损伤部位的有效浓度，从而形成具有生物学功能的组织。支架材料的研究重点在于如何修饰、复合、研发出生物相容性好，力学适应能力强，更接近生理状态的理想材料。
细胞生长因子是治疗各种原因导致的软骨损伤的有效手段，但仍存在许多问题亟待解决：在诱导过程中生长因子需要用多久？最适宜的浓度是多少？以及如何控制此浓度保持不变？这些不确定的因素限制了生长因子在软骨分化中的应用[50]。
组织工程修复关节软骨损伤这项技术已成功应用于临床，效果较好。随着不同种子细胞来源及培养技术的提高，以及各种新型支架材料的研制与开发，相信在不久的将来，关节软骨损伤将会得到更有效的治疗。
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