多中心风湿免疫病生物样本库标准化建设与意

曾惠琼，丁慧华，熊力群，唐元家，孙华麟，康晓楠，张跃，叶志中

目的探讨风湿免疫病样本的采集和保存、以及生物样本库的建立和信息化管理方法。方法以深圳市医院为依托，采用相关技术收集各类样本，包括患者的血液、尿液、DNA等;用-80℃冰箱冷冻、液氮罐等保存样本；同时建立信息系统用于风湿免疫病生物样本库的规范管理，包括样本存放位置、样本使用、实验结果分析、综合查询、质量控制、样本废除管理等；并通过云共享实现多中心生物样本库管理。结果自年1月起筹建风湿免疫病生物样本库，截至年7月31日,已经实现了对人次风湿免疫病和5人次健康对照者样本的收集和信息化管理;在生物样本库建立和维护的过程中，从样本入库、保存、出库等多个环节实现了对样本的标准化技术质量控制。结论通过建立院级风湿免疫病生物样本库与远程云共享生物样本库平台，将临床样本高质量地保存下来，为基础、临床研究提供丰富宝贵的资源，为研究的可持续发展提供保障。风湿免疫病生物样本库的建立同时也使疾病样本的储存系统化和规范化，对相关疾病早期诊断、新药研发、基因检测、遗传病发病机制等领域均有重要作用，同时也为转化医学提供基础平台。

生物样本库；风湿免疫病；标准化生物样本库是一种集中保存各种人类生物材料，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。基于收集高质量的结缔组织病组织及以血液、尿液为主的体液样本是发现风湿免疫病遗传生物标志物及药物作用新靶点的物质基础。生物样本资源的重要性已经得到充分的认识和广泛的重视[1-]。年,美国宣布启动精准医学计划；年,我国科技部将精准医学纳入到“十三五”重大科技专项。精准医学的发展同样需要生物样本库，作为专项指南明确指出，开展健康队列、重大疾病、罕见病等研究，必须有生物样本库、数据库等平台作为课题研究支撑。为了整合深圳市人群病例资源，为临床与基础科学研究提供可靠的资源平台，深圳市医院自年1月开始组建深圳市人群风湿免疫病生物样本库，并利用深圳市“三名工程”平台柔性引进上海交通大医院风湿科并与之合作，实现多中心、云共享管理模式。1材料与方法

1.1材料

1.1.1病例选择所有病例均来源于在我院门诊及住院风湿病患者，原则上，所有风湿免疫病均具备入库资格，但基于我院实际情况，我们重点采集系统性红斑狼疮(systemiclupuserethematosus,SLE)、骨性关节炎(Ostoarthritis,OA)、类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)、骨质疏松症、强直性脊柱炎、干燥综合症、系统性血管炎、未分化结缔组织病8个病种。所有患者诊断均符合各个病种诊断及治疗指南。所有入组患者均填写详细问卷，包括一般人口学、疾病、流行病学、家系等资料。

1.1.主要设备4℃冰箱，-80℃冰箱，台式离心机，Real-timePCR扩增仪，紫外/可见光光度计，电热恒温水箱，贝迪打印机,液氮罐、-0℃、-4℃冰箱、凝胶电泳分析系统。另设PCR室、分子生物室、血清室等用于提取核酸，分离淋巴细胞，进行PCR扩增等分子生物学相关研究。

1.方法

1..1人员配置与建库流程参照上海交通大医院风湿科生物样本库的建设模式[3]，参考生物样本库国际规范和指南标准化建设[4]。医院自身特点，我院生物样本库组织架构主要由以下部分组成:执行委员会、学术委员会、伦理委员会、质控小组等。在此基础上安排科研助理专员、质控专员分别负责样本的采集和前处理、核酸蛋白提取和质量管理、样本信息数据管理、样本出入库和常务管理等，并按照岗位职责的不同给予相应的培训内容、方式、要求和频率，定期参加生物样本库标准化建设会议。

1..伦理规范收集生物样本库样本必须先征得患者的知情同意并签署知情同意书。同时经过我院伦理委员会审查，严格保护患者隐私和权益。

1..3组织样本的采集和处理

1..3.1血液样本的采集与保存血清、血浆、全血(用于备提RNA，DNA和外周血单个核细胞等)。血液样本采集选用风湿病患者外周静脉采血，采集方案选择应遵循不同项目方案，成人捐献者采集量一般为10～15mL，其中10mL抗凝管，5mL促凝管。血清样本使用标准真空负压采血管，常温直立静置30min，待血液凝固析出血清，分管，标记，入库。全血采集至抗凝管充分颠倒混匀后，分装分离血浆和白细胞，标记，入库。血浆留取后分管，标记，入库，剩下部分用于分离粒细胞、外周血单个核细胞等，提取后标记，入库。核对样本标签编号后入库-80℃冰箱或液氮罐保存。

1..3.尿液样本的采集与保存尿液采集相对简单，尿液是蛋白质、代谢物的主要来源之一。我们收集风湿病患者晨尿或随机尿液、4h尿液。单次尿液采集量50mL。根据研究目的和用途，可分为混匀尿、尿液上清和尿沉渣。采集后标记，入库，将冻存管装盒后根据系统分配位置冻存于-80℃冰箱中。

1..3.3唾液样本的采集与保存目前采用唾液采集管(Salivette)采集唾液后离心获得样本，常温保存，采集后的唾液根据标准操作规程进行直接分装或低速离心，产生的上清和沉淀分别单独保存。唾液样本建议μL/管分装。若需长期保存可进行冻存(-80℃保存)。该样本与尿液一样属于无创性操作，简单易行，目前国内罕见有生物样本库存储此类样本，开发用于唾液收集和基于SOPS标准对于建立一个新的唾液生物样本库至关重要[5-7]。

1..3.4关节液样本的采集与保存多种风湿病发病以关节滑膜增生为主要病理基础，患者常伴有关节肿胀，所以，采集关节液对关节局部炎症等病变分析有重要作用。通过门诊或住院医师无菌操作取得关节液，抽出液体后，要记录液体数量，样本库留取样本分装在支无菌采集管内，其中一个管不加抗凝剂，另一个管加适量肝素抗凝用做细胞学检查；将样本贴好标识码标签，-80℃保存。

1..3.5粪便样本的采集与保存有文献证实，多种风湿病发病与肠道菌群失调相关[8]。因此，风湿病专病样本库样本也纳入了粪便采集。测定肠道菌群一般常用16SrRNA基因序列分析技术检测，因此，选择灭菌封口特定容器，收集～5g或～5cm3固态状(或～5mL液态状)新鲜粪便，无须离心，样本分管贴好标识码标签，-80℃保存。如果需要测定代谢物则将上法采集新鲜粪便用研钵研碎混匀，取0.5g，置于50mL离心管中，加入10mL75%甲醇溶液，离心取上清液，加入10%氨水备用，采用气相色谱-质谱联用法分析。

1..3.6DNA/RNA的提取按试剂盒要求提取DNA；RNA的提取选用传统的Trizol法，标记，入库，分别储于-80℃冰箱和液氮罐。在样本收集到入库整个过程中，对从样本中提取的DNA/RNA样本，需定期抽查浓度、纯度，鉴定合格后可继续保存。所有样本应避免反复冻融。

1.3临床资料库建立与信息采集系统管理

医院信息系统(hospitalinformationsystem,HIS)/实验室信息系统(laboratoryinformationsystem,LIS)/广东省医疗机构病案统计管理系统(GuangdongProvincemedicalinstitutionshealthrecordandstatistics,MIS)对接,利用存储设备，完善管理(包括样本采集、患者信息、设备、实验信息、用户信息、统计辅助等多方面管理)，方便数据科研/临床提取及校正，提高了样本库工作效率。实现对样本状态和使用情况有序化、权限化、多中心的院级共享安全管理。

1.3.1临床资料库建立与管理包括：①临床信息采集；②信息整理入库；③原始纸质临床资料存放与管理；④出入库管理；⑤库存核实；⑥样本接收、运输、销毁、安全管理；⑦云端共享管理。

1.3.临床信息采集管理将预录入样本的临床资料信息包括住院号/门诊号、性别、姓名(为保护患者隐私使用英文缩写)、诊断、家系、个人史、既往史、病史、实验室报告、药物治疗情况、预后与转归等所有信息输入信息系统内。

1.4质控管理

质控管理包括质控人员管理和样本质控。生物样本库的质量控制包括流程控制和样本质量检测。

结果

.1样本收集情况我院自年1月起筹建风湿免疫病生物样本库，于年1月开始收集样本，截至年7月31日，共计收集风湿免疫病病例人次及5人次健康对照者，主要涉及8个病种，其中SLE人次，RA人次，OA10人次，脊柱关节病40人次，骨质疏松症61人次，干燥综合征5人次，血管炎7人次，结缔组织病10人次。目前收集的人次样本中，男性33人次，占9.6%；女性人次，占70.4%，收集样本的年龄最小11岁，最大80岁。

.样本管理

..1单个样本录入路径与质控参照SOPS标准，生物样本库中样本的出入库全程实施标准化管理，必须按二维条形码识别定位归放并由专人负责管理。使用生物样本必须按照流程进行申请、审批、取样。在样本出库后管理员需追踪出库样本的基本试验数据，做到对样本的采集与库中质量的二次监管。为确保实验室全体员工熟悉生物安全法律、法规，建立生物安全意识，保证相关工作人员掌握开展工作必需的生物安全知识和技术，避免实验室感染，防止实验室事故，生物样本库工作人员需定期接受安全培训和考核。样本库收集部分血液、尿液样本编码及二维条形码见图1。

图1生物样本库血液、尿液样本编码及二维条形码

因RNA、DNA易降解，存在不稳定性，为避免样本在今后使用时反复冻融降解RAN、DNA和影响蛋白质结构，应当尽可能将样本以最小单位分装。分装也同时是为了提取方便和减少样本浪费。样本质量控制根据不同样本情况采取不同手段。例如：液态样本(血清、血浆、尿液、关节液等)需对其中特定物质定期检测；固体组织如：滑膜成分，由病理专家等共同完成，通过显微镜检查和对核酸/蛋白质等大分子检测进行质控。质控包括数据、取材处理各个环节时间记录、形态复检、生物大分子稳定性分析等等。生物样本库质控每半年进行1次，随机采样3份，使用紫外分光光度计测RNA完整性。数据信息安全是生物样本库安全的重要组成部分，安全保存采集的数据，限定使用者权限，防止数据的非法获取。每个接触生物样本库信息系统的工作人员都应该签署一份保密协议，信息系统自动备份。

..样本共同管理采用IBIO-GENE科研数据库信息管理系统V..49.0版本，实现样本储存、共享信息的可视化管理，同时具有检索、归类等多种功能。年，我院获得深圳市政府“医疗卫生三名工程”立项，成功引进上海交通大医院沈南教授风湿病精准医学研究团队。通过数据库联网，实现跨地域、多中心与上海交通大医院风湿科生物样本库实现云共享。通过积极推动生物样本库利用，避免了“脏库”、“死库”发生。同时正在进一步吸引、扩大同行业合作单位和研究范围，期望实现多中心收集标本、建立华南地区生物样本库联盟，扩大和维持研究竞争力、可持续发展势态。

3讨论

SLE，OA、RA等[9-10]风湿免疫病属于高度异质性风湿病，发病机制复杂，严重影响国民健康与国家经济。据统计，美国因此每年造成经济损失多达亿美元以上。流行病学调查显示，我国仅RA的发病率达0.6%～1.0%，自身免疫性风湿病患者人数已超过1亿，到00年将达亿；而临床上SLE、RA等风湿免疫性疾病目前主要采用抗炎和免疫抑制方法进行治疗，以糖皮质类激素联合细胞毒药物为主，不良反应大，感染已成为风湿免疫性疾病致死的首要因素。因此，寻找风湿免疫病生物标志物、新的治疗靶向药、中西医结合等方向治疗成为全球共同

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